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Lehrstuhl für Botanik I - Pflanzenphysiologie und Biophysik

Sclerostin

Sclerostin - ein Negativregulator der Knochenentwicklung

Das SOST-Gen wurde 2003 in einer Genom-weiten Mutationsanalyse bei der Suche nach molekularen Ursachen der beiden Knochenhyperplasie-Erkrankungen Sklerosteose und dem van-Buchem Syndrom identifiziert. Beide sehr seltenen, autosomal-rezessiv vererbten Erkrankungen zeichnen sich durch massiv überschießendes Knochenwachstum unter anderem im Schädelbereich aus. Dies kann unbehandelt bei Betroffenen zu Fazialisparesen und Ertaubung führen, dem durch operative Entfernung von Knochenmaterial entgegengewirkt werden kann. Da beide Erkrankung aufgrund von Funktionsverlustmutationen im SOST Gen verursacht werden, stellt das Genprodukt, das sekretierte Glykoprotein Sclerostin, somit einen Negativregulator der Knochenentwicklung dar. Entgegen erster Vermutungen beeinflusst Sclerostin die Knochenhomöostase jedoch nicht durch den BMP- sondern moduliert den Wnt-Signalweg.

Biochemische und biophysikalische Analysen auch unserer Arbeitsgruppe konnten zur Aufklärung des molekularen Wirkmechanismus dieses neuartigen Wnt-Antagonisten beitragen (1-3). Die Bindung von Sclerostin an Wnt Ko-Rezeptoren der LRP5/6-Familie blockiert dort die Bindestelle für Wnt-Faktoren und verhindert somit die Aktivierung des Wnt-Rezeptors, die durch Assemblierung eines Komplexes von Rezeptoren der Frizzled-Familie und LRP5/6 Ko-Rezeptoren zustande kommt. Die Aufklärung der Struktur von Sclerostin mittels Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) zusammen mit einer detaillierten Mutageneseanalyse ergab, dass ein kurzer Sequenzabschnitt in der zweiten Schleife des Cystinknotenproteins Sclerostin das für die Bindung an LRP5/6 essentielle und somit die Funktion verantwortliche Epitop bildet (3,4).

Besonderes Interesse haben gegen Sclerostin gerichtete und dessen Wirkung neutralisierende Antikörper erlangt, da diese die von Sclerostin-vermittelte das Knochenwachstum hemmende Wirkung aufheben. Derartige Antikörper können bei Erkrankungen, die zu einem Abbau des Knochens führen, die Knochendichte regenerieren. Insbesondere für Osteoporose würde diese osteoanabole Behandlungsmethode ein neuartiges Therapiekonzept darstellen, welches den derzeitigen Methoden die in erster Linie weiteren Knochenabbau verhindern, klar überlegen ist. In Zusammenarbeit mit Bio-Rad AbD Serotec konnte unsere Arbeitsgruppe ebenfalls zwei eigene Sclerostin-neutralisierende Antikörper entwickeln (5,6). Die Aufklärung der Strukturen dieser beider Antikörper mittels Röntgenbeugung ergab erste Einblicke, welche Bereich von Sclerostin idealerweise blockiert werden müssen (7,8). Diese Daten können nun verwendet werden, um neue nicht-Proteinbasierende Sclerostin-Inhibitoren für zukünftige Osteoporosetherapien zu entwickeln.

  1. Krause C, Korchynskyi O, de Rooij K, Weidauer SE, de Gorter DJ, van Bezooijen RL, Hatsell S, Economides AN, Mueller TD, Lowik CW et al: Distinct modes of inhibition by sclerostin on bone morphogenetic protein and Wnt signaling pathways. J Biol Chem 2010, 285(53):41614-41626.
  2. Piters E, Culha C, Moester M, Van Bezooijen R, Adriaensen D, Mueller T, Weidauer S, Jennes K, de Freitas F, Lowik C et al: First missense mutation in the SOST gene causing sclerosteosis by loss of sclerostin function. Hum Mutat 2010, 31(7):E1526-1543.
  3. Boschert V, van Dinther M, Weidauer S, van Pee K, Muth EM, Ten Dijke P, Mueller TD: Mutational analysis of sclerostin shows importance of the flexible loop and the cystine-knot for wnt-signaling inhibition. PLoS One 2013, 8(11):e81710.
  4. Weidauer SE, Schmieder P, Beerbaum M, Schmitz W, Oschkinat H, Mueller TD: NMR structure of the Wnt modulator protein Sclerostin. Biochem Biophys Res Commun 2009, 380(1):160-165.
  5. Back JW, Frisch C, Van Pee K, Boschert V, van Vught R, Puijk W, Mueller TD, Knappik A, Timmerman P: Selecting highly structure-specific antibodies using structured synthetic mimics of the cystine knot protein sclerostin. Protein Eng Des Sel 2012, 25(5):251-259.
  6. Boschert V, Muth EM, Knappik A, Frisch C, Mueller TD: Crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of the sclerostin-neutralizing Fab AbD09097. Acta Crystallogr F Struct Biol Commun 2015, 71(Pt 4):388-392.
  7. van Dinther M, Zhang J, Weidauer SE, Boschert V, Muth EM, Knappik A, de Gorter DJ, van Kasteren PB, Frisch C, Mueller TD et al: Anti-Sclerostin Antibody Inhibits Internalization of Sclerostin and Sclerostin-Mediated Antagonism of Wnt/LRP6 Signaling. PLoS One 2013, 8(4):e62295.
  8. Boschert V, Frisch C, Back JW, van Pee K, Weidauer SE, Muth EM, Schmieder P, Beerbaum M, Knappik A, Timmerman P et al: The sclerostin-neutralizing antibody AbD09097 recognizes an epitope adjacent to sclerostin's binding site for the Wnt co-receptor LRP6. Open Biol 2016, 6(8).
Die Hyperosteosen Sklerosteose und van Buchem Syndrom führen zu einem massiv überschießenden Knochenwachstum. Diese Abbildung illustriert den dramatischen Zuwachs an Knochenmasse mittels eines Vergleichs der Schädelmassen von gesunden Personen und dem Schädel eines van Buchem Patienten sichtbar, letzterer hat eine etwa viermal so hohe Knochenmasse.
Abb. 1: Die Abbildung illustriert den enormen Gewichtszuwachs des Schädels eines van Buchem (VBD) Patienten. Der Verlust einer 52 Kilobasen langen Region am untranslatierten 3’ Ende des SOST-Gens, welche ein Verstärkerelement für die Transkription enthält, führt zu einer stark verminderten Expression von Sclerostin, einem Negativregulator des Knochenwachstums und Antagonisten des Wnt-Signalwegs. Das gesteigerte Knochenwachstum in VBD Betroffenen führt zu einer etwa vierfachen Knochenmasse im Vergleich mit gesunden Personen. (Grafik: Oxford University Press)
Überlagerung von 15 NMR-Strukturen von Sclerostin aus der Maus. Rechts ist die Sekundärstruktur von murinem Sclerostin zusammen mit dem charakteristischen Cystin-Knoten Motiv abgebildet. Letzteres zeichnet sich dadurch aus, dass zwei Disulfidbrücken einen äußeren Ring bilden, durch den eine dritte Disulfidbrücke verläuft und somit einen Knoten bildet.
Abb. 2: (linke Abbildung) NMR-Strukturensemble von murinem Sclerostin, für eine bessere Übersicht sind nur die Hauptkettenatome C, O, C und N gezeigt. Die Überlagerung zeigt 15 Strukturen, die mit den NMR-Daten aus (4) berechnet wurden. Sclerostin weist eine länglich gestreckte Architektur auf, die beiden vom Cystinknoten in die gleiche Richtung ausgehenden Schleifen (Schleifen 1 und 3), bilden zwei jeweils zweisträngige -Faltblätter (als Finger 1 und 2 bezeichnet), die zweite vom Cystinknoten in die entgegengesetzt verlaufende Schleife liegt hingegen unstrukturiert vor und weist eine hohe Flexibilität und Dynamik auf. (rechte Abbildung) Bänderstrukturdarstellung einer repräsentativen NMR Struktur von murinem Sclerostin. Sclerostin weist ein Cystinknotenmotiv auf, hierbei bilden sechs Cysteinreste drei Disulfidbrücken (hier als gelbe Stäbchen dargestellt), von denen zwei einen äußeren Ring bilden, durch den die dritte Disulfidbrücke verläuft und somit einen Knoten bildet. (Grafik: T. Müller, Universität Würzburg 2017)
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(Grafik: T. Müller, Universität Würzburg 2017)