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Lehrstuhl für Botanik I - Pflanzenphysiologie und Biophysik

Licht-aktivierte Cyclasen

Licht-aktivierte Cyclasen: PAC & Cyclop

Bereits 2002 wurden von einer japanischen Arbeitsgruppe Licht-gesteuerte Adenylyl-Cyclasen in dem einzelligen Chrloroplasten enthaltenden Flagellat Euglena gracilis entdeckt (Iseki et al., 2007, Nature) und Photoactivated Adenylyl Cyclase (PAC) a und b benannt. Die Verwendung von PAC aus Euglena (EuPAC) als optogenetisches Werkzeug in tierischen Zellen und der Taufliege Drosophila melanogaster (durch Martin Schwärzel, jetzt FU Berlin) wurde von uns in Zusammenarbeit mit anderen Gruppen 2007 gezeigt (Schröder-Lang et al., Nature Methods), siehe Abb.

Heterologe Expression von PAC erlaubt schnelle Konzentrationserhöhung von cAMP in Zellen auf Belichtung, die durch cAMP-sensitive Ionenkanäle on-line gemessen wird, siehe Schema. Der menschliche Anionenkanal CFTR wird durch die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) aktiviert, was mit einer Leitfähigkeitserhöhung einhergeht. Die Abb. zeigt, dass die Leitfähigkeit durch die Gabe von IBMX und Forskolin (erhöhen cAMP durch endogene Cyclasen) oder durch Belichtung (Aktivierung von PACa)  erreicht werden kann. Weitere PAC’s wurden in Genom-Daten von Mikroben gefunden und von uns und anderen charakterisiert. Besonders attraktiv erscheint hierbei PAC aus dem Bakterium Beggiatoa (bPAC), da sie nur 350 Aminosäuren groß ist und ein hohes Verhältnis von Aktivität im Licht zu Aktivität im Dunkeln (L/D) aufweist. Durch Mutagenese und Gen-Fusion verändern und verbessern wir derzeit die Eigenschaften von bPAC.

2014 zeigte eine brasilianische Gruppe, dass in dem aquatischen Pilz Blastocladiella emersonii eine Rhodopsin-Fusion mit einer Guanylyl-Cyclase exprimiert und durch grünes Licht aktiviert wird (Avelar et al., 2014, Curr. Biol.). Wir liessen die DNA dafür synthetisieren und charakterisierten das Protein nach heterologer Expression in Oozyten oder HEK293-Zellen. Nach ausführlicher Charakterisierung (Gao et al., 2015, Nat. Commun.) benannten wir das Protein Cyclase Opsin oder kurz Cyclop und zeigten auch hierbei Licht-aktivierte Ströme nach Koexpression eines cGMP-sensitiven Kationenkanals, siehe Abb.

Zur Zeit arbeiten wir an Genfusionen von Cyclop und an Mutationen um aus der Guanylyl-Cyclase eine Adenylyl-Cyclase herzustellen: Cyclop-PAC

Die Abbildung zeigt links das Schema einer Oozyte mit Messelektroden und heterolog exprimierten Proteinen und rechts 2 Leitfähigkeitsspuren einer Oozyte, in der ein cAMP-sensitiver Anionen-Kanal (CFTR) sowie die Licht-sensitive Adenylyl-Cyclase PAC aus Euglena gracilis exprimiert werden.
Heterologe Expression von PAC erlaubt schnelle Konzentrationserhöhung von cAMP in Zellen auf Belichtung, die durch cAMP-sensitive Ionenkanäle on-line gemessen wird, siehe Schema in A. Der menschliche Anionenkanal CFTR wird durch die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) aktiviert, was mit einer Leitfähigkeitserhöhung einhergeht. Die Abb. zeigt, dass die Leitfähigkeit derselben Zelle durch die Gabe von IBMX und Forskolin während der durch den Balken angezeigten Zeit (Erhöhung von cAMP durch endogene Enzyme, siehe B) oder durch Belichtung (Aktivierung von PAC, siehe C) erreicht werden kann. (Grafik: G. Nagel, Universität Würzburg 2017)
Garfik
(Grafik: G. Nagel, Universität Würzburg 2017)
Die Abbildung zeigt links (A) das Schema einer Oozyte mit heterolog exprimiertem Cyclop und CNG-Kationenkanal. Rechts daneben ist eine Stromspur in B gezeigt,
Heterologe Expression von Cyclop erlaubt schnelle Konzentrationserhöhung von cGMP. A: Schema einer Oozyte mit heterolog exprimiertem Licht-sensitiven Cyclop und CNG-Kationenkanal. B: Schnelle Aktivierung eines CNG-vermittelten Einwärtsstromes nach Lichtblitz von 100 ms Dauer. (Grafik: S. Gao, Universität Würzburg 2015)
sowie das Aktionsspektrum von Cyclop mit Maximum bei ca. 530 nm in C.
C: Aktionsspektrum der Licht-stimulierten cGMP-Generierung durch Cyclop. (Grafik: G. Nagel, Universität Würzburg 2017)